技术领域

本发明涉及微小RNA(microRNA)抑制剂。

背景技术：

微小RNA为18-25mer的小RNA，其由基因组转录并调控靶基因的表达。 已知微小RNA的异常表达深度介入许多疾病如癌症等中，且近年来已极力进 行了将微小RNA作为诊断和治疗的靶标的研究。抑制微小RNA的方法包括使 用LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)的方法，且该方法在欧洲和美国处于 临床阶段。作为微小RNA的其它抑制方法，存在称为微小RNA Sponge(海绵) 的技术(非专利文献1)。

[文献列表]

[非专利文献]

非专利文献1：NATURE METHODS,4:72

技术实现要素：

发明要解决的问题

然而，由于使用LNA的方法需要使用特定的修饰核酸，因而其缺乏广泛 的实用性。此外，尽管微小RNA海绵具有广泛的实用性，但其还具有的问题 在于RNA分子容易被降解酶降解。

因此，本发明旨在提供一种具有广泛的实用性且难以降解的微小RNA抑 制剂。

用于解决问题的方案

为了实现前述目的，本发明的微小RNA抑制剂的特征在于其具有与为抑 制靶标的微小RNA的序列互补的两个以上的序列，且前述两个以上的互补序 列经连接子残基连接。

发明的效果

由于本发明的微小RNA抑制剂不需要使用特定的修饰核酸，因而其在广 泛的实用性方面占优，且由于前述互补序列经连接子残基连接而难以降解。

附图说明

图1示出本发明微小RNA抑制剂的示例性组成。

图2示出本发明微小RNA抑制剂的示例性序列。

图3示意性示出错配序列的实例。

图4示出实施例1的微小RNA的表达水平通过qPCR的确认结果。

图5为海肾荧光素(Renilla luciferase)基因通过用于实施例的质粒表达的 示意图。

图6为萤火虫荧光素(firefly luciferase)基因通过用于实施例的不同质粒 表达的示意图。

图7为示出实施例2-1的微小RNA抑制剂的miR-16活性抑制效果的图。

图8为示出实施例2-2的微小RNA抑制剂的miR-16活性抑制效果的图。

图9为示出实施例2-3的微小RNA抑制剂的miR-16活性抑制效果的图。

图10为示出实施例3的微小RNA抑制剂的miR-16活性抑制效果的图。

图11为示出实施例4中使用HCT116细胞比较Gly型海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和GlyGly型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的miR-16 活性抑制效果的图。

图12为示出实施例4中使用HCT116细胞比较GlyGly型海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和TPA型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的 miR-16活性抑制效果的图。

图13为示出实施例4中使用HCT116细胞比较GlyGly型海绵低聚体 (sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和TPA型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的 miR-16活性抑制效果的另一图。

图14也为示出实施例4中使用HCT116细胞比较GlyGly型海绵低聚体 (sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和TPA型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的 miR-16活性抑制效果的另一图。

图15为示出实施例4中使用HEK293T细胞比较Gly型海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和GlyGly型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的miR-16 活性抑制效果的图。

图16为示出实施例4中使用HEK293T细胞比较Gly型海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和GlyGly型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的miR-16 活性抑制效果的另一图。

图17为示出实施例4中使用HEK293T细胞比较Gly型海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)和GlyGly型海绵低聚体(微小RNA抑制剂)的miR-16 活性抑制效果的另一图。

图18为示出实施例5中使用HCT116细胞比较当miR-16结合序列为完美 型(Perfect type)、泡型(Bubble type)或凸型(Bulge type)时的海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)的miR-16活性抑制效果的图。

图19为示出实施例5中使用HEK293T细胞比较当miR-16结合序列为完美 型、泡型和凸型时的海绵低聚体(sponge oligo)(微小RNA抑制剂)的miR-16活 性抑制效果的图。

具体实施方式

下面参考实施例详细解释本发明。然而，本发明不受下列说明的限定。

本发明的微小RNA抑制剂优选具有键合至存在于微小RNA抑制剂两末 端的前述互补序列的各端部的连接子残基。以该形式，可进一步抑制降解。

在本发明的微小RNA抑制剂中，前述连接子残基优选包含选自由氨基酸 残基、聚酰胺残基和多元羧酸残基组成的组的至少之一。前述连接子残基可 包含或可不包含除氨基酸残基、聚酰胺残基和多元羧酸残基以外的残基。例 如，前述连接子残基可为多元羧酸残基、对苯二甲酸残基和氨基酸残基中任一。

本发明中，“聚酰胺”意指包含多个(两个、三个或更多)氨基的任意化合 物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。本发明中，前述聚 酰胺不特别限定，其实例包括1,4-苯二胺、1,3-苯二胺和1,2-苯二胺等。此外， 在本发明中，“多元羧酸”意指包含多个(两个、三个或更多)羧基的任意化合 物。本发明中，前述多元羧酸不特别限定，其实例包括1,4-二羧基苯(对苯二 甲酸)、1,3-二羧基苯(间苯二甲酸)和1,2-二羧基苯(邻苯二甲酸)。另外，本发 明中，“氨基酸”意指如下所述分子中包含一个以上的氨基和一个以上的羧基 的任意有机化合物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。

在本发明的微小RNA抑制剂中，存在于前述两个以上的互补序列之间的 氨基酸残基可为多个互连的氨基酸残基。本发明中，为多个互连的氨基酸残 基的氨基酸残基为例如包含肽结构的残基。更具体地，为多个互连的氨基酸 残基的前述氨基酸残基为例如下述化学式(I)的氨基酸残基，其中下述化学式 (Ia)为肽(例如，甘氨酸二聚体或甘氨酸三聚体等)。

在本发明的微小RNA抑制剂中，前述氨基酸残基可为甘氨酸残基、对苯 二甲酰胺残基或脯氨酸残基。

在本发明的微小RNA抑制剂中，键合至前述互补序列的端部的氨基酸残 基可为多个互连的氨基酸残基。另外，在本发明的微小RNA抑制剂中，存在 于两个以上的互补序列之间的前述氨基酸残基和键合至前述互补序列的端 部的氨基酸残基的至少之一可为甘氨酸二聚体或三聚体的残基。

本发明中，前述互补序列可为RNA或DNA。

本发明中，连接前述两个以上的互补序列的氨基酸残基不特别限定，如 上所述可使用例如甘氨酸残基、对苯二甲酰胺残基或脯氨酸残基。另外，前 述氨基酸残基可为修饰的氨基酸残基或氨基酸衍生物。连接(结合)前述两个 以上的互补序列的氨基酸残基可为单一氨基酸残基或彼此连接的两个以上 的氨基酸残基。

本发明中，如上所述，存在于微小RNA抑制剂的两末端的前述互补序列 优选具有前述连接至各端部的连接子残基。前述连接子残基可为例如氨基酸 残基。在前述氨基酸残基不特别限定的同时，其为例如甘氨酸残基、对苯二 甲酰胺残基或脯氨酸残基。连接前述两个以上的互补序列的氨基酸残基可为 单一氨基酸残基或两个以上的氨基酸残基。

本发明中，前述互补序列与为抑制靶标的微小RNA全部或部分互补。当 序列部分互补时，优选其与从微小RNA环的3′侧或5′侧的序列互补。前述互 补序列可包含与微小RNA的环部分全部或部分互补的序列。前述互补序列的 数目为两个以上，例如2-10、优选3-8、更优选4-6。在前述互补序列的碱 基数不特别限定的同时，其可为例如约20-25个碱基。前述互补序列可如上 所述为RNA或DNA，或可为DNA和RNA的混合物。构成前述互补序列的核 酸优选为天然核酸。然而，本发明不限于此，且可为例如修饰核酸。另外， 构成前述互补序列的核酸可为例如人工核酸如LNA(BNA)和PNA等。从广泛 的实用性和便利的方面，如上所述优选天然核酸。

本发明微小RNA抑制剂的构成的实例示于图1。如该图所示，在该实例 的微小RNA抑制剂1中，三个互补序列2经两个连接子残基(如氨基酸残基)3 连接，连接子残基3还连接至互补序列2两端的各端部。另外，本发明微小RNA 抑制剂的序列的实例在hsa-miR-15a作为微小RNA为抑制靶标时示于图2。在 该实例中，前述互补序列(SEQ ID NO:1)与hsa-miR-15a的全长序列互补。

5’-CACAAACCATGCCTGCTGCTA-3’(SEQ ID NO:1)

在本发明的微小RNA抑制剂中，前述互补序列可与例如微小RNA全部或 部分完全互补(完全匹配)，或可包含错配。当本发明的微小RNA抑制剂包含 错配时，由裂解双链核酸的酶(Dicer等)的裂解受到抑制，并且降解优选变得 更加困难。前述错配不特别限定。例如，1个碱基至几个碱基的错配可存在 于前述互补序列的中心部分，或前述互补序列的中心部分可为凸(Bulge)(除 靶序列的互补序列以外，中心部分中包含1个碱基至几个碱基的额外序列[例 如，约4个碱基])。前述互补序列的前述“中心部分”不特别限定，只要其不同 于前述互补序列的末端的碱基即可。图3示意性示出错配的实例以及完全匹 配的实例。图3(a)为示出完全匹配的实例的示意图，图3(b)为示出前述凸的实 例的示意图，图3(c)为示出前述互补序列在其中心部分具有1个碱基至几个碱 基的错配的实例的示意图。在图3(a)-(c)各图中，下侧的白色链示出靶序列 (全部或部分微小RNA)，上侧的黑色链示出前述互补序列。图3(b)和(c)(特别 是图3(c))的错配的实例有时指凸型等。可选地，图3(a)的完全匹配的实例有 时指完美型，图3(b)的实例有时指凸型，图3(c)的实例有时指泡型。

本发明微小RNA抑制剂可通过例如如下所示的化学合成来制造。

前述化学合成方法不特别限定，其实例包括亚磷酰胺法和H-磷酸酯(盐) 法等。在前述化学合成法中，例如，可使用商购可得的自动核酸合成仪。在 前述化学合成法中，例如，可使用亚酰胺(amidite)。前述亚酰胺不特别限定， 且商购可得的亚酰胺的实例包括RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名， Samchully Pharm Co.,Ltd.)、ACE亚酰胺、TOM亚酰胺、CEE亚酰胺、CEM 亚酰胺和TEM亚酰胺等。本发明的微小RNA抑制剂优选用于例如前述氨基酸 残基合成中的本发明的下述单体。

在本发明的微小RNA抑制剂中，前述连接子残基由例如下列化学式(I-0) 表示

在前述化学式(I-0)中，

Q11和Q12各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S (硫代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O或S,

Q1和Q2各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基、C＝O(羰基)、C＝S(硫 代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O或S，

Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；

L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或

L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或

L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；

m为0至30范围内的整数；

n为0至30范围内的整数；

与前述微小RNA的序列互补的序列经-OR1-或-OR2-键合至前述连接子残基， 当前述连接子残基存在于前述微小RNA的互补序列之间时，R1和R2可存在或 可不存在，且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I-0)；

当前述连接子残基存在于在末端处存在的前述微小RNA的互补序列的端部 时，R1和R2各自独立地为H、保护基或磷酸保护基(phosphate-protecting group)；和

A为任意原子团。

在前述化学式(I-0)中，例如，Q11可为C＝O(羰基)，Q1可为NH(亚氨基)。 另外，例如，Q11可为NH(亚氨基)，Q1可为C＝O(羰基)。另外，例如，Q12可为C＝O(羰基)，Q2可为NH(亚氨基)。此外，例如，Q12可为NH(亚氨基)， Q2可为C＝O(羰基)。

在前述化学式(I-0)中，Q11和Q12各自可为例如羰基。在该情况下，Q1和 Q2各自优选亚氨基。另外，在该情况下，下列化学式(Iα)的结构更优选由下 列化学式(Iα2)表示。

在前述化学式(Iα2)中，

R100为任意取代基，其可存在或可不存在，且当其存在时，其可单独或多个 存在，且当其多个存在时，它们可彼此相同或不同。前述针对R100的任意取 代基包括下述示例为Ra、Rb、Rc和Rd的取代基。其更具体的实例包括卤素、 羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、羰基、氨磺酰基、烷基、烯基、 炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环 基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡 咯基和咪唑基等。前述化学式(Iα2)的结构更优选由下列化学式(Iα3)表示。

当Q11和Q12为羰基时，Q1和Q2为亚氨基，前述化学式(I-0)的连接子残基 可为羧酸酰胺残基或羧酸残基。例如，下述实例中的“TPA”结构可为由前述 化学式(Iα3)表示的对苯二甲酰胺残基或对苯二甲酸残基。

在前述化学式(I-0)中，各Q11和Q12可为亚氨基。在该情况中，各Q1和Q2优选羰基。在该情况中，下述化学式(Iβ)的结构更优选由下述化学式(Iβ2)表 示。

在前述化学式(Iβ2)中，

R100为任意取代基，其可存在或可不存在，且当其存在时，其可单独或多个 存在，且当其多个存在时，它们可彼此相同或不同。具体地，例如，与前 述化学式(Iα2)中的R100相同。另外，前述化学式(Iβ2)的结构更优选 由下列化学式(Iβ3)表示。

在本发明的微小RNA抑制剂中，当前述连接子残基为氨基酸残 基时，前述氨基酸残基由例如下列化学式(I)表示。下列化学式(I) 的结构为由前述化学式(I-0)表示的结构的一个实例。

在前述化学式(I)中，例如，

X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；

Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；

L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或

L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或

L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；

m为0至30范围内的整数；

n为0至30范围内的整数；

与前述微小RNA的序列互补的序列经-OR1-或-OR2-各自键合至前述氨基酸 残基，

当前述氨基酸残基存在于前述微小RNA的互补序列之间时，R1和R2可存在或 可不存在，且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)； 当前述氨基酸残基存在于在末端处存在的前述微小RNA的互补序列的端部 时，R1和R2各自独立地为H、保护基或磷酸保护基；和

A为任意原子团，下列化学式(Ia)为氨基酸或肽。

在前述化学式(I)中，例如，X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH。在前 述化学式(I)中，\"X1为H2\"意指X1与X1所结合的碳原子一起形成CH2(亚甲基)。 这同样适用于X2。

在前述化学式(I)中，Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S。

在前述式(I-0)和(I)中，L1为具有n个碳原子的亚烷基链。一个(或多个)前 述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可被或可不被例如OH、ORa、NH2、 NHRa、NRaRb、SH或SRa取代。可选地，L1可为通过用氧原子取代前述亚烷 基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。前述聚醚链为，例如聚乙二醇。当 Y1为NH、O或S，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳， 且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y1为O时，该氧原子和L1中的氧原子彼 此不相邻，OR1中的氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻。

在前述式(I-0)和(I)中，L2为具有m个碳原子的亚烷基链。一个(或多个) 前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可被或可不被例如OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代。可选地，L2可为通过用氧原子取代前 述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。当Y2为NH、O或S，L2中键 合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即， 例如，当Y2为O，该氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻，OR2中的氧原子和 L2中的氧原子彼此不相邻。

L1的n和L2的m不特别限定，并且例如它们各自的下限可为0，其上限不 特别限定。例如，n和m可根据前述氨基酸残基的期望长度适当地设定。例如， 从制造成本和产量等的观点，n和m各自优选0至30，更优选0至20，并更加优 选0至15。n和m可相同(n＝m)或不同。n+m为例如0至30，优选0至20，更优 选0至15。

例如，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基，并可相同或不同。 前述取代基的实例包括羟基、羧基、磺基、卤素、卤化烷基(卤代烷基，如 CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙 基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷 基)、环烷基烷基(如环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、环 基烷基、羟烷基(如羟甲基、羟乙基)、环氧基烷基(如甲氧基甲基、乙氧基甲 基、乙氧基乙基)、芳基(如苯基、萘基)、芳烷基(如苯甲基、苯乙基)、烷芳 基(如对甲苯基)、杂芳基(如吡啶基、呋喃基)、杂芳基烷基(如吡啶基甲基)、 杂环基(如哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(如吗啉基甲基)、烷氧基(如甲 氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤化烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基 氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧 基羰基、叔丁氧基羰基)、芳烷基氧基(如苄氧基)、氨基-[烷基氨基(如甲基氨 基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳 烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、羟氨基]、氨基烷基(如氨基甲基)、 烷基氨基烷基(如二乙氨基甲基)、氨基甲酰基、氨磺酰基、氧基、甲硅烷基 和甲硅烷氧基烷基等。这些取代基任选地被一种或多种另外的取代基或另外 的保护基取代。在前述另外的取代基不特别限定的同时，例如其可为上述列 举的取代基。前述另外的保护基不特别限定，例如其可为下述列举的保护基。 下文同。

前述保护基(或前述另外的保护基)为使例如高反应性官能团失活的官能 团。保护基的实例包括已知的保护基。关于前述保护基，例如，文献中的记 载(J.F.W.McOmie,\"Protecting groups in Organic Chemistry\",Plenum Press, London和New York,1973)可包括于此。前述保护基不特别限定，并且其实例 包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三 异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基 甲基(CEM)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)和二甲氧基三苯甲基(DMTr)。 保护基的其它实例包括由稍后示出的化学式(P1)和(P2)表示的含甲硅烷基的 基团。下文同样适用。

在前述式(I-0)和(I)中，氢原子各自独立地可由例如卤素如F、Cl、Br或I 取代。

在本发明的微小RNA抑制剂中，前述互补序列为经例如-OR1-或-OR2-各 自键合至前述连接子残基(氨基酸残基)。R1和R2可存在或可不存在。且当R1和R2存在时，R1和R2可各自独立地为核苷酸残基或前述化学式(I-0)或(I)表示 的结构。当R1和/或R2为前述核苷酸残基时，前述连接子残基(例如，氨基酸 残基)由例如具有前述化学式(I-0)或(I)的结构的不包括核苷酸残基R1和/或R2的前述非核苷酸残基和(一个或多个)前述核苷酸残基组成。当R1和/或R2为由 前述化学式(I-0)或(I)表示的结构时，前述连接子残基(例如，氨基酸残基)的 结构为例如两个以上的具有前述化学式(I-0)或(I)的结构的前述非核苷酸残 基相互连接这样的结构。前述化学式(I-0)或(I)的结构数可为例如1、2、3或4。 当连接子残基(例如，氨基酸残基)包括多个前述结构时，前述化学式(I-0) 或(I)的结构可例举直接或经前述(一个或多个)核苷酸残基连接。另一方面， 当R1和R2不存在时，前述连接子残基(例如氨基酸残基)仅由例如具有前述化 学式(I-0)或(I)的前述非核苷酸残基组成。

本发明中，前述化学式(I)中的原子团A不特别限定，且为任意选择的； 然而，下列化学式(Ia)示出如上所述的氨基酸或肽。

前述式(I)、(IA)或(Ia)中的原子团A可包含或可不包含例如选自由链式原 子团、脂环式原子团、芳族性原子团和杂芳族性原子团组成的组的至少之一。 当前述链式原子团不特别限定时，例如可提及烷基、烯基、炔基、卤烷基、 羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。在当前述脂 环式原子团不特别限定时，例如可提及环烷基、环烯基、环烷基烷基和环基 烷基等。当前述芳族性原子团不特别限定时，例如可提及芳基、芳烷基、烷 芳基、稠环芳基、稠环芳烷基和稠环烷芳基等。前述杂芳族性原子团不特别 限定，其实例包括杂芳基、杂芳烷基、烷基杂芳基、稠环杂芳基、稠环杂芳 烷基和稠环烷基杂芳基等。在前述化学式(I)、(IA)或(Ia)中的原子团A中，各 前述原子团可进一步具有或可不进一步具有取代基或保护基。当前述取代基 或保护基是多个时，它们可相同或不同。前述取代基为例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的那些，更具体地，例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺 基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳 烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基 烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述保护 基例如与前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的那些相同。

在本发明中，“氨基酸”是指如上所述分子中含有至少一个氨基和至少一 个羧基的任意有机化合物。前述“氨基”不限定为-NH2基团，还包括亚氨基 (-NH-)。例如，脯氨酸和羟脯氨酸等的分子中不含有-NH2基团，但含有亚氨 基(-NH-)，并包括在本发明的“氨基酸”的定义中。本发明中，前述“氨基酸” 可为如下所述的天然氨基酸或人工氨基酸。例如，由下述化学式(Ia2)或(Ia3) 表示的化合物分子中也包含氨基和羧基，因此，其包括在本发明的“氨基酸” 的定义中。因此，例如，前述化学式(I)的结构，其中原子团A由下述化学式 (A2)或化学式(A2a)表示，包括在本发明的“氨基酸残基”的定义中。另外，例 如，下述实例中的“TPA”结构也包括在本发明的“氨基酸残基”的定义中。此 外，本发明中，“肽”是指具有其中不小于2分子的氨基酸经肽键键合的结构 的有机化合物。前述肽键可为酰胺结构或酰亚胺结构。当多个氨基存在于由 前述化学式(Ia)表示的氨基酸或肽分子中时，清楚示于前述化学式(Ia)中的氨 基可为任意氨基。另外，当多个羧基存在于由前述化学式(Ia)表示的氨基酸 或肽分子中时，清楚示于前述化学式(Ia)中的羧基可为任意羧基。

在本发明微小RNA抑制剂的前述氨基酸残基中，前述氨基酸可为例如如 上所述的天然氨基酸或人工氨基酸。本发明中，“天然氨基酸”是指具有天然 存在的结构或其光学异构体的氨基酸。前述天然氨基酸的制造方法不特别限 定，例如其可从天然产物中提取，或可合成。此外，在本发明中，“人工氨 基酸”是指具有不天然存在的结构的氨基酸。即，前述人工氨基酸为氨基酸， 即含有氨基的羧酸衍生物(分子中含有至少一个氨基和至少一个羧基的有机 化合物)且具有不天然存在的结构。前述人工氨基酸优选不含有例如杂环。 前述氨基酸可为构成例如蛋白质的氨基酸。前述氨基酸可为例如至少一种选 自由甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、 谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫 氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、 色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸和由 下列化学式(Ia2)表示的氨基酸组成的组的氨基酸，并可进一步具有或可不进 一步具有取代基或保护基。前述取代基的实例包括前述Ra、Rb、Rc和Rd所列 举的取代基。更具体地，例如，可提及卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、 磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、 芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧 基烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述保 护基与例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的保护基相同。当前述化学式(Ia)的 氨基酸，其不是肽，含有异构体如光学异构体、几何异构体和立体异构体等， 可使用任何异构体。

在前述化学式(Ia2)中，

R100为任意取代基，其可存在或可不存在，且当其存在时，其可单独或多个 存在，且当其多个存在时，它们可彼此相同或不同。前述R100的任意取代基 的实例包括示例为前述Ra、Rb、Rc或Rd的那些。其更具体的实例包括卤素、 羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、羰基、氨磺酰基、烷基、烯基、 炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环 基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡 咯基和咪唑基等。另外，前述化学式(Ia2)的结构可为例如下列化学式(Ia3)。

当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia2)时，前述化学式(I)中的原子 团A的结构由下列化学式(A2)表示。下列化学式(A2)中的R100与前述化学式 (Ia2)中的R100相同。另外，当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia3)时，前 述化学式(I)中的原子团A的结构由下列化学式(A2a)表示。

前述化学式(I)的结构的实例包括下列化学式(I-1)-(I-6)。在下列化学式 (I-1)-(I-6)中，n和m与前述化学式(I)中的相同。

在前述化学式(I-1)至(I-6)中，n和m不特别限定，且为如上所述的。其具 体实例包括前述化学式(I-1)中n＝11和m＝12，前述化学式(I-4)中n＝5和m＝4， 前述化学式(I-6)中n＝4和m＝4。结构由下列化学式(I-1a)、(I-4a)和(I-6a)表示。

本发明中，\"烷基\"包括例如直链和支化的烷基。前述烷基的碳数不特别 限定，并为例如1至30，优选1至6，更优选1至4。前述烷基的实例包括：甲 基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、 异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。其 中，例如优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔 丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基和异己基等。

本发明中，\"烯基\"包括例如直链或支化的烯基。前述烯基为例如具有一 个或多个双键的前述烷基。前述烯基的碳数不特别限定，并例如与前述烷基 的碳数相同，优选2-8。前述烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、 1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基和3-甲基-2-丁烯基等。

本发明中，\"炔基\"包括例如直链或支化的炔基。前述炔基的实例为例 如具有一个以上的三键的前述烷基。前述炔基的碳数不特别限定，并例如与 前述烷基的碳数相同，优选2-8。前述炔基的实例包括乙炔基、丙炔基和丁 炔基。前述炔基可进一步包括例如一个以上的双键。

本发明中，\"芳基\"包括例如单环芳族烃基和多环芳族烃基。前述单环芳 族烃基的实例包括苯基等。前述多环芳族烃基的实例包括1-萘基、2-萘基、 1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基和9-菲基等。优 选，例如苯基，和萘基如1-萘基和2-萘基等，等等。

本发明中，\"杂芳基\"包括例如单环芳族杂环基和稠合芳族杂环基。前述 杂芳基的实例包括呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(如2-噻吩基、3- 噻吩基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(如1-咪唑基、 2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(如1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(如1-四唑基、2- 四唑基、5-四唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(如 3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(如2-噻唑基、4-噻唑基、5- 噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(如3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、 吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(如3-哒嗪基、4-哒嗪基)、 嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咕基(furazanyl)(如3-呋咕基)、 吡嗪基(如2-吡嗪基)、噁二唑基(如1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(如2-苯并 [b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b] 呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(如2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩 基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、 苯并咪唑基(如1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、 二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(如2-喹喔啉基、5-喹喔 啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(如3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、 7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(如2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、 6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(如2-喹啉基、3-喹啉基、4- 喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(如1-酞嗪基、 5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(如1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、 5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(如2- 蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(如1- 吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(如1-吲哚基、 2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚 基、吩嗪基(如1-吩嗪基、2-吩嗪基)或吩噻嗪基(如1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、 3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)等。

本发明中，\"环烷基\"为例如环状饱和烃基，碳数为例如3-15，前述环烷 基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥接环 烃基和螺烃基等，优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基和桥接环烃基等。

本发明中，\"桥接环烃基\"为例如二环[2.1.0]戊基、二环[2.2.1]庚基、二环 [2.2.2]辛基和二环[3.2.1]辛基、三环[2.2.1.0]庚基、二环[3.3.1]壬烷、1-金刚烷 基和2-金刚烷基等。

本发明中，\"螺烃基\"为例如螺[3.4]辛基等。

本发明中，\"环烯基\"包括例如环状不饱和脂族烃基，碳数为例如3-7。前 述环烯基的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基和环庚烯基 等，优选环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基和环己烯基等。前述\"环烯基\"包括 例如在环中具有不饱和键的桥接环烃基和螺烃基。

本发明中，\"芳烷基\"为例如苯甲基、2-苯乙基或萘甲基等。\"环烷基烷基 \"或\"环基烷基\"为例如环己基甲基或金刚烷基甲基等。\"羟烷基\"为例如羟甲基 或2-羟乙基等。

本发明中，\"烷氧基\"包括例如前述烷基-O-基团，并可提及例如甲氧基、 乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基等。\"烷氧基烷基\"为例如甲氧基甲 基等。\"氨烷基\"为例如2-氨基乙基等。

本发明中，\"杂环基\"为例如1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1- 吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、 4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑烷酮、1-吡唑啉基、 3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、 哌啶子基(piperidino)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、 哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基或四氢呋喃基等。

本发明中，\"杂环基烷基\"包括例如哌啶基甲基和哌嗪基甲基等。\"杂环基 烯基\"包括例如2-哌啶基乙烯基等。\"杂芳烷基\"包括例如吡啶基甲基和喹啉-3- 基甲基等。

本发明中，术语\"甲硅烷基\"包括由化学式R3Si-表示的基团，其中R可独 立地选自前述烷基、芳基和环烷基，并例如可提及三甲基甲硅烷基和叔丁基 二甲基甲硅烷基等。\"甲硅烷氧基\"为例如三甲基甲硅烷氧基等。\"甲硅烷氧基 烷基\"为例如三甲基甲硅烷氧基甲基等。

本发明中，\"亚烷基\"为例如亚甲基、亚乙基或亚丙基等。

本发明中，前述各种基团任选地被取代。前述取代基的实例包括羟基、 羧基、磺基、卤素、卤化烷基(卤代烷基，如CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、 亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、 炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(如环己基甲基、 金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、环基烷基、羟烷基(如羟甲基、羟乙 基)、烷氧基烷基(如甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基)、芳基(如苯基、 萘基)、芳烷基(如苯甲基、苯乙基)、烷芳基(如对甲苯基)、杂芳基(如吡啶基、 呋喃基)、杂芳烷基(如吡啶基甲基)、杂环基(如哌啶基)、杂环基烯基、杂环 基烷基(如吗啉基甲基)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤 化烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、 烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳烷氧基(如苯甲 基氧基)、氨基-[烷基氨基(如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(如 乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、 羟基氨基]、氨烷基(如氨基甲基)、烷基氨烷基(如二乙基氨基甲基)、氨基甲 酰基、氨磺酰基、氧基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。

本发明中，引入前述连接子残基(下文中指“本发明的单体”或简称“单体”) 用的分子任选地具有例如下列化学式(II-0)的结构。除另有特别说明，由前述 化学式(I-0)表示的连接子残基上的说明可被引用用于本发明的具有下列化 学式(II-0)的结构的单体。

在前述化学式(II-0)中，

Q11和Q12各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S (硫代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O或S，

Q1和Q2各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S(硫 代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O或S，

Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；

R11和R21各自独立地为H、保护基或磷酸保护基；或，

L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或

L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或

L2为通过用氧原子取代亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR21的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；

m为0至30范围内的整数；

n为0至30范围内的整数；和

A为原子团。

本发明的单体(引入前述连接子残基用的分子)任选地具有例如下列化学 式(II)的结构。除非另有特别说明，由前述化学式(I)表示的连接子残基(氨基 酸残基)的说明可被引用用于本发明的具有下列化学式(II)的结构的单体。

在前述化学式(II)中，

X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；

Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；

R11和R21各自独立地为H、保护基或磷酸保护基；或，

L1为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或

L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR11的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

L2为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被 OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或

L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，

条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR21的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；

Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；

m为0至30范围内的整数；

n为0至30范围内的整数；和

A为原子团，下列化学式(Ia)为氨基酸或肽。

通过使用由前述化学式(II-0)或(II)表示的本发明的单体，例如，在合成 本发明的微小RNA抑制剂时，由前述化学式(I-0)或(I)表示的氨基酸残基可容 易合成。本发明的单体可例如在本发明的微小RNA抑制剂的合成中用作自动 核酸合成用的亚酰胺，并适用于例如通用自动核酸合成仪。前述合成方法的 实例包括亚磷酰胺法和H-膦酸酯(盐)法。

在前述化学式(II-0)或(II)中，前述化学式(I-0)或(I)的说明可被引用用于 在前述化学式(I-0)或(I)中的相同部分。具体地，在前述化学式(II-0)或(II)中， 例如，对前述化学式(I-0)或(I)的说明可被引用用于X1、X2、Y1、Y2、L1、L2、 m、n和A。

在前述化学式(II-0)或(II)中，R11和R21如上所述各自独立地为H、保护基 或磷酸保护基。

前述保护基的说明与例如前述化学式(I-0)或(I)中的相同，其具体实例可 选自例如下列基团I。前述基团I包括DMTr基团、TBDMS基团、ACE基团、 TOM基团、CEE基团、CEM基团、TEM基团和由下列化学式(P1)或(P2)表示 的含甲硅烷基的基团。前述保护基特别优选DMtr基团和前述含甲硅烷基的基 团中任一。

前述磷酸保护基可由例如下列化学式表示：

-P(OR6)(NR7R8) (P3)

在前述化学式(P3)中，R6为氢原子或任意取代基。例如，取代基R6优选 为烃基，前述烃基可被或可不被吸电子基团取代。取代基R6的实例包括卤素、 卤烷基、杂芳基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基 烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳烷基，和如烷基、烯基、炔基、芳基、 芳烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基和环基烷基等的烃类，其可被或可不 被吸电子基团取代。取代基R6的具体实例包括β-氰乙基、硝基苯乙基和甲基。

R7和R8各自为氢原子或任意取代基，且它们可相同或不同。取代基R7和R8优选为例如烃基，且前述烃基可被或可不被任意取代基进一步取代。前 述烃基的实例与上述关于R6的描述中所列的那些相同，并且所述烃基优选甲 基、乙基或异丙基。在该情况中，-NR7R8的具体实例包括二异丙基氨基、二 乙氨基和乙基甲基氨基。可选地，取代基R7和R8结合以任选地同与之键合的 一个(或多个)氮原子(即，-NR7R8作为全部)形成含氮环(例如，哌啶基或吗啉 基等)。

由前述化学式(P3)表示的磷酸保护基的具体实例包括选自下组II的那 些。组II由-P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)和-P(OCH3)(N(i-Pr)2)组成。在前述化学 式中，i-Pr为异丙基。

在前述化学式(II-0)或(II)中，例如，R1和R2之一可为H或保护基，另一个 可为H或磷酸保护基。当R1为前述保护基时，R2优选为H或前述磷酸保护基。 当R1选自前述组I时，R2优选H或选自前述由化学式(P3)表示的磷酸保护基， 更优选H或选自前述组II。当R1为前述磷酸保护基时，R2优选H或前述保护基。 当R1为由前述化学式(P3)表示的磷酸保护基或选自前述组II时，R2优选H或选 自前述组I。

前述化学式(II-0)或(II)的结构的实例包下列化学式(II-1)-(II-6)。在下列 化学式(II-1)-(II-6)中，n和m与前述化学式(II-0)或(II)中的相同。

在前述化学式(II-1)至(II-6)中，n和m不特别限定，且为如上所述。其具 体实例包括，前述化学式(II-1)中n＝11和m＝12，前述化学式(II-1)中n＝5和m＝4， 前述化学式(II-6)中n＝4和m＝4。结构通过下列化学式(II-1a)、(II-4a)和(II-6a) 示出。

在本发明中的单体的制造方法不特别限定的同时，例如，如下列流程1 所示，下列化合物(Ic)可由化合物(Ib)制造，其中前述氨基酸(Ia)的氨基通过 缩合反应受保护基R31保护，(IIa)由(Ic)产生，(IIa)转化为(II)。下列流程1为实 例且本发明不限于此。在下列化学式(Ib)和(Ic)中，保护基R31为例如Fmoc(9- 芴基甲氧基羰基)、Z(苄氧基羰基)和BOC(叔丁氧基羰基)等。在下列化学式 (Ib)、(Ic)和(IIa)中，Y1、Y2、L1、L2、R11和R21如前述化学式(II)的所述。下 列化合物(IIa)为前述式(II)的化合物，其中X1为O和X2为O。下述化学式(IIa) 中的羰基氧可适当地转化为前述化学式(II)中的X1和X2。当转化不是必须的 时候，下列化合物(IIa)可直接用作化合物(II)。在本发明由前述化学式(II-0) 表示的单体的制造方法不特别限定的同时，例如，其可为下列流程1的制造 方法或根据下列流程1的制造方法。具体地，例如，本发明的由前述化学式 (II-0)表示的单体还可通过除了使用聚酰胺或多元羧酸等代替下列化学式(Ib) 的氨基酸以外与下列流程1类似的制造方法来制造。

本发明中的单体及其制造方法进一步由下列流程2和2a具体示例。然而， 下列流程2和2a为实例，本发明不限于此。在下列流程2和2a中，“Fmoc”为9- 芴基甲氧基羰基，“iPr”为异丙基，“Tr”为三苯甲基或三苯基甲基，和“ODMTr” 为4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基。下文中相同。

本发明的单体优选包括例如标记物质。特别优选本发明的单体包括稳定 同位素。

当本发明的单体包括同位素如前述稳定同位素时，前述同位素可容易引 入前述本发明的微小RNA抑制剂分子中。包括同位素的前述单体可由例如已 引入前述同位素的氨基酸(Ia)的原料合成。本发明中，获得已引入前述同位 素的氨基酸(Ia)的方法不特别限定。例如，可通过适当方法制造，或可使用 商购可得的产品。

作为引入稳定同位素的氨基酸，例如，如下列流程3所示，引入重氢(D) 的氨基酸可通过用LiAlD4处理氨基酸(Ia)，并进一步氧化OH基来制造。

作为引入其它稳定同位素的氨基酸，引入重氧(18O)的氨基酸可通过如下 列流程4所示，在碱性条件下使氨基酸(Ia)的甲基酯与H218O反应来制造。

作为引入有稳定同位素的肽，例如，引入有氚(D)的肽可通过用如下列 流程3a所示的LiAlD4处理肽键来制造。

作为引入有稳定同位素的肽，例如引入有重氧(18O)的肽，通过例如如下 列流程4a所示，在碱性条件下使羧酸甲基酯与H218O反应，其后将下列化学 式中的羧酸与氨基或亚氨基缩合形成肽键来制造。

另外，包括引入重氮(15N)或重碳(13C)等的氨基酸或肽的制造方法不特别 限定，其可通过适当的方法制造。

具有稳定同位素引入其中的单体可以上述方式合成。通过使用前述单体 作为合成用亚酰胺，可合成其中稳定同位素引入前述氨基酸残基的本发明微 小RNA抑制剂。本发明微小RNA抑制剂的端部的结构可为核酸。然而，优选 连接子残基，更优选氨基酸残基(氨基酸或肽)。

在本发明单体的使用不特别限定的同时，优选自动核酸合成。可选地， 本发明的单体优选用于制造核酸分子，且前述核酸分子更优选为本发明的前 述微小RNA抑制剂。

实施例

下文中，将参考实施例等详细描述本发明，但不应理解为限制本发明。

[甘氨酸残基[Gly]引入用分子的合成]

在下述各实施例和参考例的寡核苷酸(微小RNA抑制剂)中，甘氨酸残基 (Gly)引入用分子(本发明的单体)如下合成。

即，根据下列流程5，合成十二烷氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲基氧 基十二烷氨基亚磷酰胺(6)。化合物(6)为甘氨酸残基(Gly)引入用分子，且为 本发明前述单体的一个实施方案。下列流程5中的“Gly”为由下式表示的结 构，即具有其中氨基的一个氢原子与羧基的OH从甘氨酸中除去的结构的原 子团。下面，除非另有说明，否则“Gly”显示下列化学式的结构。下列流程5 中，Gly的NH侧键合至Fmoc或羰基碳，Gly的羰基碳(CO)侧键合至OH或N原子。

(Gly)

―HN-CH2-CO-

(1)12-三氟乙酰氨基十二烷醇(化合物1)

将12-氨基十二烷醇(4.81g,23.9mmol)和三氟乙酸乙基酯(6.79g, 47.8mmol)的乙醇溶液(100ml)在室温下搅拌过夜。反应混合物在减压下浓 缩，从而给出无色浆液状的12-三氟乙酰氨基十二烷醇(1)(6.98g,q.)。

(2)12-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基胺(化合物2)

化合物1(3.00g,10.08mmol)通过与无水吡啶共沸蒸馏干燥三次。向共沸 蒸馏残留物添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(4.32g,12.1mmol)和无水吡啶 (50ml)，并室温搅拌混合物过夜。向所得反应混合物添加甲醇(10ml)并室温 搅拌混合物30分钟。在室温减压下蒸发溶剂直至混合物变为约30mL。之后， 添加二氯甲烷(200ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物三次，并进一步 用饱和盐水洗涤。经硫酸钠干燥混合物，并在减压下蒸发溶剂。向由此获得 的未纯化的残留物在甲醇中的溶液(100ml)添加氢氧化钠(2.02g,50.40mmol) 并室温搅拌混合物过夜。反应混合物在减压下浓缩直至其变为约30mL。添 加水(100ml)和二氯甲烷(200ml)，并将有机层分级。将分级的有机层用饱和 盐水洗涤并经硫酸钠干燥。然后，将干燥剂(硫酸钠)滤出并在减压下蒸发溶 剂。将得到的残留物通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％ 吡啶)纯化，从而给出12-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基胺(2)(5.19g, q.)。下面示出12-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基胺(2)的仪器分析值。

12-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基胺(2)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.45-7.43(2H,m),7.34-7.25(6H,m),7.21-7.20(1H,m), 6.83-6.79(4H,m),3.78(6H,s),3.04-3.01(2H,t,J＝6.3Hz),2.70-2.67(2H,t,J＝6.8Hz), 1.61-1.54(6H,m),1.33-1.24(14H,m).

(3)Fmoc-甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(化合物3)

在室温下氩气气氛下向Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH，购自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(2.00g,6.73mmol)、二环己基碳化二亚胺(1.66g, 8.07mmol)和1-羟基苯并三唑一水合物(2.31g,16.14mmol)在无水N,N-二甲基 甲酰胺中的溶液(70ml)添加化合物2(4.07g,8.07mmol)在无水N,N-二甲基甲酰 胺中的溶液(30ml)，并室温下在氩气气氛下搅拌混合物过夜。滤出所得沉淀， 并在35℃减压下浓缩滤液。向所得残留物添加二氯甲烷(200ml)，并用饱和碳 酸氢钠水溶液洗涤混合物3次。将有机层分级，经硫酸钠干燥并在减压下蒸 发溶剂。将得到的残留物通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇 (95:5)+0.05％吡啶)，从而给出无色浆液状的Fmoc-甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧 基三苯甲氧基丁基十二酰胺(3)(5.88g,q.)。

(4)甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(化合物4)

室温下向化合物3(5.88g,6.73mmol)添加N,N-二甲基甲酰胺(10ml)和哌啶 (4.8mL)并室温下搅拌混合物过夜。在减压下蒸发溶剂并将所得残留物进行 硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出甘氨酸-4,4’- 二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(4)(3.44g,91％)。下面示出甘氨酸-4,4’-二甲氧 基三苯甲氧基十二酰胺(4)的仪器分析值。

甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(4)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.47-7.44(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.21-7.20(1H,m), 6.83-6.80(4H,m),3.79(6H,s),3.34(2H,s),3.30-3.25(2H,t,J＝6.6Hz), 3.06-3.02(2H,t,J＝6.3Hz),1.64-1.50(6H,m),1.38-1.25(14H,m).

(5)羟基十二烷基酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(化 合物5)

化合物4(3.15g,5.62mmol)通过与无水吡啶共沸蒸馏三次干燥，在氩气气 氛下室温下添加12-羟基十二烷酸(3.41g,6.74mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳化二亚胺盐酸盐(1.29g,6.74mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(2.06g, 13.48mmol)和无水二氯甲烷(50ml)，并搅拌混合物10分钟。向由此获得的混 合物添加三乙胺(2.05g,20.22mmol)，并在氩气气氛下室温搅拌混合物过夜。 向所得反应混合物添加二氯甲烷(200ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合 物三次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。将有机层分级，经硫酸钠干燥，并 减压下蒸发溶剂。将所得残留物通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇 (95:5)+0.05％吡啶)，从而给出无色浆液状的羟基十二烷基酰氨基甘氨酸-4,4’- 二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(5)(2.97g,70％)。下面示出羟基十二烷基酰氨 基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(5)的仪器分析值。

羟基十二烷基酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二酰胺(5)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.42-7.40(2H,m),7.33-7.26(6H,m),7.22-7.21(1H,m), 6.83-6.80(4H,m),3.84(2H,s),3.79(6H,s),3.64-3.61(2H,t,J＝6.3Hz), 3.26-3.24(2H,t,J＝6.1Hz),3.08-3.06(2H,t,J＝5.6Hz),2.28-2.24(2H,t,J＝6.8Hz), 1.69-1.52(12H,m),1.44-1.39(26H,m).

(6)十二烷基酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二烷基酰氨基 亚磷酰胺(化合物6)

化合物5(2.78g,3.76mmol)通过与无水吡啶共沸蒸馏干燥三次。接着， 添加二异丙基四唑化铵(772mg,4.51mmol)，在减压下除去混合物的空气， 用氩气填充并添加无水乙腈(3mL)。此外，添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四 异丙基亚磷酰二胺(1.36g,4.51mmol)在无水乙腈二氯甲烷中的溶液(3mL)，并 在氩气气氛下室温搅拌混合物4小时。向所得反应混合物添加二氯甲烷 (150ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物两次，并进一步用饱和盐水洗 涤一次。将有机层分级，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。将残留物进行 氨基硅柱层析(洗脱液：正己烷-丙酮(7:3)+0.05％吡啶)，从而给出十二烷基酰 氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二烷基酰氨基亚磷酰胺(6)(2.72g, 77％,HPLC 98.5％)。下面示出十二烷基酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲 氧基十二烷基酰氨基亚磷酰胺(6)的仪器分析值。

十二烷基酰氨基甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基十二烷基酰氨基亚磷 酰胺(6)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.41-7.49(m,2H),7.26-7.30(m,6H),7.17-7.19(m,1H), 6.80-6,83(m,4H),6.46-6.62(m,2H),4.07-4.29(m,2H),3.89(d,J＝5.4Hz,2H), 3.75-3.87(m,4H),3.67(s,6H),3.47-3.70(m,4H),3.20-3.26(m,2H),3.02(t, J＝6.4Hz,2H,CH2),2.63(t,6.4Hz,2H,CH3),1.56-1.63(m,6H),1.47-1.51(m,2H), 1.24-1.33(m,26H),1.13-1.20(m,12H):

P-NMR(CDCl3):δ＝146.62.

在各实施例和各参考例的寡核苷酸中，“Gly”实际由下列化学式(G1)表 示。即，在下列实施例和参考例各自的核苷酸的结构式(序列)中，下列化学 式(G1)中除Gly以外的部分为简化而省略。下列化学式(G1)中的N原子键合至 Gly的羰基碳(CO)侧，下列化学式(G1)中的羰基碳键合至Gly的NH侧。另外， 在下述实施例和参考例各自的寡核苷酸中，当没有碱基键合(未记载)至Gly 的5’末端时(即，下列(G1))，氢原子(H)键合至5’末端。

[甘氨酸二聚体残基[GlyGly]引入用分子的合成]

在下述实施例和参考例各自的寡核苷酸(微小RNA抑制剂)中，如下合成 甘氨酸二聚体残基(GlyGly)引入用分子(本发明的单体)。

即，己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁基酰胺基亚磷酰 胺(16)根据下列流程6合成。化合物(16)为甘氨酸二聚体残基(GlyGly)引入用 分子，且为前述本发明单体的一个实例。下列流程6中的“Gly”如上所述显示 由下列化学式表示的结构；即，具有其中氨基的一个氢原子和羧基的OH已 从甘氨酸中除去的结构的原子团。除非另有说明，在下列流程6中，“GlyGly” 具有其中两个Gly连接形成肽键的结构(如下)。在下列流程6中，Fmoc或羰基 碳键合至GlyGly的NH侧，OH或N原子键合至Gly的羰基碳(CO)侧。

(Gly)

-HN-CH2-CO-

(GlyGly)

-HN-CH2-CO-HN-CH2-CO-

(1)4-三氟乙酰氨基丁醇(化合物11)

4-氨基丁醇(2.50g,28.05mmol)和三氟乙酸乙基酯(19.92g,140.26mmol) 在乙醇中的溶液(100ml)室温下搅拌过夜。反应混合物在减压下浓缩，从而给 出无色浆液状的4-三氟乙酰氨基丁醇(11)(5.44g,q.)。

(2)4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丁胺(化合物12)

化合物1(4.15g,22.40mmol)通过与无水吡啶共沸蒸馏干燥三次。向共沸 蒸馏残留物添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(9.60g,28.3mmol)和无水吡啶 (100ml)，并室温下搅拌混合物过夜。向所得反应混合物添加甲醇(10ml)，将 混合物在室温下搅拌30分钟，并室温减压下蒸发溶剂至约20mL。之后，添 加二氯甲烷(200ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物三次，并进一步用 饱和盐水洗涤。混合物经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。向由此获得的未 纯化的残留物(9.00g)在四氢呋喃中的溶液(50ml)添加氢氧化钠(3.71g, 92.7mmol)在水中的溶液(70ml)。在室温下强力搅拌混合物的同时添加四丁基 氟化铵三水合物(180mg)并进一步室温强力搅拌混合物过夜。向所得反应混 合物添加乙酸乙酯(200ml)和水(100ml)，并将有机层分级。进一步用乙酸乙 酯提取水层，并将提取物与预先分级的有机层结合，并经硫酸钠干燥。之后， 滤出干燥剂(硫酸钠)并减压下蒸发溶剂。所得残留物进行硅胶柱层析(洗脱 液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基) 丁胺(12)(6.36g,87％)。下面示出4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丁胺(12)的仪器 分析值。

4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丁胺(2)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.42-7.45(m,2H),7.26-7.34(m,12H), 7.17-7.20(m,1H),6.80-6.84(m,4H),3.79(s,6H),3.48(s,2H,NH2),3.06(t,6.8Hz, 2H,CH2),2.67(t,7.4Hz,2H,CH2),1.60-1.65(m,2H,CH2),1.49-1.55(m,2H, CH2)

(13)Fmoc-甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁胺(化合物13)

在氩气气氛冰冷下向Fmoc-甘氨酰甘氨酸(Fmoc-GlyGly-OH，购自China Langchem)(2.50g,7.05mmol)、二环己基碳化二亚胺(1.75g,8.46mmol)和1-羟 基苯并三唑一水合物(2.59g,16.92mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液 (70ml)添加化合物12(3.31g,8.46mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液 (50ml)。在除去冰浴后，在氩气气氛下将混合物室温搅拌过夜。滤出所得沉 淀物，并在35℃减压下浓缩滤液。向所得残留物添加二氯甲烷(200ml)，并用 饱和盐水洗涤混合物两次。将有机层分级，经硫酸钠干燥并在减压下蒸发溶 剂。将残留物通过硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(95:5)+0.05％吡啶，接 着二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出无色浆液状的Fmoc-甘氨酰甘 氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁胺(13)(3.49g,68％)。

(14)甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁胺(化合物14)

室温下向化合物13(3.00g,4.12mmol)添加乙腈(5mL)和哌啶(2.4mL)，并 室温搅拌混合物过夜。减压下蒸发溶剂，并将所得残留物进行硅胶柱层析 (洗脱液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出甘氨酰甘氨酸-4,4’-二 甲氧基三苯甲氧基丁胺(14)(1.13g,54％)。下面示出甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲 氧基三苯甲氧基丁胺(14)的仪器分析值。

甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁胺(14)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.40-7.42(m,2H),7.25-7.31(m,12H), 7.19-7.21(m,1H),6.80-6.84(m,4H),3.89(d,J＝5.9Hz,2H),3.79(s,6H),3.37(s, 2H),3.25(t,J＝5.8Hz,2H,CH2),2.67(t,J＝5.8Hz,2H,CH2),1.57-1.65(m,4H, CH2).

(15)羟基己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁胺(化合物 15)

化合物14(1.07g,2.11mmol)通过与无水乙腈共沸蒸馏干燥三次，室温添 加6-羟基己酸(336mg,2.54mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺 盐酸盐(487mg,2.54mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(778mg,5.08mmol)和无 水二氯甲烷(20ml)，并在氩气气氛下搅拌混合物10分钟。向由此获得的混合 物添加三乙胺(778mg,5.08mmol)，并在氩气气氛下室温搅拌混合物。向所得 反应混合物添加二氯甲烷(150ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物三 次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。将有机层分级，经硫酸钠干燥，并减压 下蒸发溶剂。所得残留物通过硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷-甲醇 (95:5)+0.05％吡啶)，从而给出无色浆液状的羟基己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’- 二甲氧基三苯甲氧基丁胺(15)(890mg,68％)。下面示出羟基己酰胺基甘氨酰 甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁酰胺(15)的仪器分析值。

羟基己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁胺(15)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.41-7.42(m,2H),7.27-7.34(m,12H), 7.18-7.21(m,1H),6.81-6.83(m,4H),3.92(d,J＝5.43Hz,2H,CH2),3.84(d, J＝5.9Hz,2H),3.79(s,6H),3.60(m,2H,CH2),3.23-3.28(m,2H,CH2), 3.05-3.10(m,2H,CH2),2.56(t,J＝7.3Hz,2H,CH2),1.50-1.72(m,8H), 1.30-1.45(m,2H,CH2).

(16)己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁基酰胺基亚磷 酰胺(化合物16)

化合物15(824mg,1.33mmol)通过与无水吡啶共沸蒸馏干燥三次。接着， 添加二异丙基四唑化铵(274mg,1.60mmol)，并在减压下除去混合物的空气， 用氩气填充，并添加无水乙腈(1mL)。此外，添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’- 四异丙基亚磷酰二胺(482mg,1.60mmol)在无水乙腈中的溶液(1ml)，并在氩气 气氛下室温搅拌混合物4小时。向所得反应混合物添加二氯甲烷(100ml)，并 用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物两次，并进一步用饱和盐水洗涤一次。将 有机层分级，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。残留物进行氨基硅柱层析 (洗脱液：二氯甲烷-丙酮(7:3)+0.05％吡啶)，从而给出己酰胺基甘氨酰甘氨酸 -4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁基酰胺基亚磷酰胺(16)(938mg,86％,HPLC 98.2％)。下面示出己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁基酰胺 基亚磷酰胺(16)的仪器分析值。

己酰胺基甘氨酰甘氨酸-4,4’-二甲氧基三苯甲氧基丁基酰胺基亚磷酰胺 (16)；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.36-7.47(m,3H),7.24-7.30(m,5H),7.18-7.19(m,1H), 6.80-6.82(m,4H),3.92(d,J＝4.9Hz,2H,CH2),3.84(d,J＝5.4Hz,2H),3.76(s,6H), 3.73-3.85(m,4H),3.54-3.64(m,4H),3.18-3.25(m,2H,CH2),3.05-3.10(m,2H, CH2),2.60(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.23(t,7.4Hz,2H,CH2),1.55-1.68(m,8H), 1.30-1.45(m,2H,CH2).1.15-1.18(m,12H):

P-NMR(CDCl3):δ＝146.57.

HPLC：保留时间6.25分钟(Shimadzu SPD-10AV(XBridge OST C18,4.6 mM×50mm))

在下列各实施例中，各实施例和各参考例的寡核苷酸中的“GlyGly”实际 由下列化学式(G2)表示。即，在下列实施例和参考例各自的核苷酸的结构式 (序列)中，下列化学式(G2)中除GlyGly的部分为简化而省略。下列化学式(G2) 中的GlyGly具有其中上述两个Gly连接形成肽键的结构。下列化学式(G2)中 的N原子键合至GlyGly的羰基碳(CO)侧，下列化学式(G2)中的羰基碳键合至 GlyGly的NH侧。另外，在下述实施例和参考例各自的寡核苷酸中，当没有 碱基键合(未记载)至GlyGly的5’末端时(即，下列(G2))，氢原子(H)键合至5’ 末端。

[对苯二甲酰胺残基[TPA]引入用分子的合成]

在下述实施例和参考例各自的寡核苷酸(微小RNA抑制剂)中，对苯二甲 酸亚酰胺，其为对苯二甲酰胺残基(TPA)引入用分子(本发明的单体)，根据下 列流程7合成。在TPA记为“对苯二甲酰胺残基”的同时，其也可为对苯二甲酸 残基。

(1)化合物17

4-氨基丁醇(2.50g,28.05mmol)和三氟乙酸乙基酯(19.92g,140.22mmol) 在乙醇中的溶液(100ml)室温搅拌过夜。反应混合物在减压下浓缩，从而给 出化合物17(5.20g,q.)。

(2)化合物18

化合物17(5.20g,28.05mmol)和4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(11.40g, 33.66mmol)在无水吡啶中的溶液(20ml)室温干燥过夜。添加二氯甲烷 (200ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物三次，并进一步用饱和盐水洗 涤。经硫酸钠干燥后，减压下蒸发溶剂。向由此获得的未纯化残留物在甲醇 中的溶液(100ml)添加氢氧化钠(5.61g,140.23mmol)，并室温搅拌混合物过夜。 反应混合物在减压下浓缩，添加水(200ml)，并用二氯甲烷(200ml)提取混合 物两次。将有机层分级，经硫酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。所得残留物进 行硅胶柱层析(洗脱液：二氯甲烷-甲醇(9:1)+0.05％吡啶)，从而给出化合物 18(8.20g,75％)。下面示出化合物18的仪器分析值。

化合物18；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.44-7.42(2H,m),7.34-7.25(6H,m),7.20(1H,d, J＝7.3Hz),6.82(4H,m),3.78(6H,s),3.06(2H,t,J＝6.3Hz),2.68(2H,t,J＝7.1 Hz),1.59(4H,m).

(3)化合物19

对苯二甲酸单甲基酯(3.00g,16.65mmol)、4-氨基丁醇(0.89g, 9.98mmol)、二环己基碳化二亚胺(2.06g,9.98mmol)、1-羟基苯并三唑一水合 物(3.06g,19.96mmol)和三乙胺(5.05g,49.9mmol)在无水四氢呋喃中的溶液 (70ml)回流的同时搅拌5小时。室温冷却后，滤出所得沉淀物，并在减压下浓 缩滤液。向残留物添加乙酸乙酯(50ml)，并通过过滤收集沉淀物，从而给出 目标化合物19(1.52g)。在减压下浓缩滤液，并用甲苯洗涤。通过过滤收集沉 淀物，从而给出目标化合物19(0.83g)。向滤液添加二氯甲烷(200ml)，并用饱 和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物两次，并进一步用饱和盐水洗涤。在经硫酸钠 干燥后，减压下蒸发溶剂，从而给出目标化合物19(0.37g)。产生总的所得目 标产物(化合物19)2.72g，产率为65％。下面示出化合物19的仪器分析值。

化合物19；

1H-NMR(CDCl3):δ＝8.10-8.07(2H,m),7.83(2H,m),3.94(3H,s),3.74(2H,t, J＝5.9Hz),3.50(2H,m),1.92(2H,dd,J＝12.7,3.4Hz),1.80-1.65(2H,m).

(4)化合物20

化合物19(2.33g,9.27mmol)和氢氧化钠(1.85g,46.36mmol)在甲醇中的溶 液(70ml)室温搅拌过夜。在减压下浓缩反应混合物，并添加水。另外，用2N (2mol/L)的盐酸调整混合物至pH 2。通过过滤收集所得沉淀物并在减压下干 燥，从而给出目标化合物20(1.95g,89％)。下面示出化合物20的仪器分析值。

化合物20；

1H-NMR(DMSO-d6):δ＝8.00(2H,d,J＝8.3Hz),7.92(2H,d,J＝8.3Hz), 1.72(2H,d,J＝12.7Hz),1.63-1.45(4H,m),1.15(2H,m).

(5)化合物21

在氩气气氛下将化合物18(3.09g,7.88mmol)、化合物20(1.70g, 7.16mmol)、二环己基碳化二亚胺(1.63g,7.88mmol)、1-羟基苯并三唑一水合 物(2.41g,15.76mmol)和三乙胺(3.62g,35.80mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺 中的溶液(170ml)室温搅拌过夜。所得反应混合物在减压下浓缩，添加二氯甲 烷(300ml)，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物3次。将有机层分级，经硫 酸钠干燥，并减压下蒸发溶剂。残留物用甲苯研磨，通过过滤收集所得沉淀 物并在减压下干燥，从而给出目标化合物21(3.94g,90％)。下面示出化合物21 的仪器分析值。

化合物21；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.76-7.67(4H,m),7.40(2H,d,J＝7.3Hz),7.27(6H,m), 7.19(1H,m),6.80(4H,d,J＝8.8Hz),3.78(6H,s),3.73(2H,t,J＝5.9Hz), 3.48(4H,m),3.12(2H,t,J＝5.6Hz),1.72(8H,m).

(6)化合物22

化合物21(1.50g,2.46mmol)通过与无水吡啶共沸蒸馏干燥三次。接着， 添加二异丙基四唑化铵(630mg,3.68mmol)，在减压下除去混合物的空气，用 氩气填充，并添加无水二氯甲烷(1mL)。此外，添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’- 四异丙基亚磷酰二胺(1.11g,3.68mmol)在无水二氯甲烷中的溶液(1ml)，并在 氩气气氛下室温搅拌混合物4小时。向所得反应混合物添加二氯甲烷(200ml)， 并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤混合物3次。将有机层分级，经硫酸钠干燥， 并减压下蒸发溶剂。将残留物用二氯甲烷溶解，并进行氨基硅柱层析(洗脱 液：正己烷-丙酮(7:3)+0.05％吡啶)，从而给出化合物22(1.86g,93％)。下面示 出化合物22的仪器分析值。

化合物22；

1H-NMR(CDCl3):δ＝7.74(4H,m),7.41(2H,m),7.31-7.24(6H,m),7.20(1H, m),6.80(4H,m),3.85-3.56(10H,m),3.45(4H,m),3.12(2H,t,J＝5.9Hz), 2.60(2H,dd,J＝11.0,4.6Hz),2.16(2H,t,J＝3.4Hz),1.72(8H,t,J＝5.9Hz), 1.17(12H,m).

31P-NMR(CDCl3):δ＝147.10.

下述各实施例和各参考例的寡核苷酸中的“TPA”实际具有下列化学式。 另外，在下述实施例和参考例各自的寡核苷酸中，当没有碱基键合(未记载) 至TPA的5’末端时，氢原子(H)键合至5’末端。

[实施例1]

使用hsa-miR-16-5p和hsa-miR-122两种微小RNA作为抑制靶标，如下所 述，微小RNA抑制剂通过前述化学合成法制造。首先，前述互补序列与前述 两种微小RNA的全部或部分序列互补。三个前述互补序列通过甘氨酸残基 (Gly)连接，甘氨酸残基(Gly)还连接至存在于两端的前述互补序列的各端部。 前述两种微小RNA抑制剂引入Huh-7细胞，在引入后24小时回收的微小RNA 的表达水平通过qPCR确认。结果示于图4。如图所示，显然本实施例的两种 微小RNA抑制剂(海绵低聚体(Sponge Oligo))与不引入它们时(正常)相比显著 抑制微小RNA。

在实施例1和下述实施例(包括参考例)中，微小RNA抑制剂通过核酸分 析仪(商品名ABI Expedite(注册商标)8909 Nucleic Acid Synthesis System, applied biosystems)基于亚磷酰胺法由3’侧向5’侧合成。在前述合成中，RNA 亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm Co.,Ltd.)用作RNA亚酰 胺。作为DNA亚酰胺，使用DNA亚磷酰胺(Samchully Pharm Co.,Ltd.)。另外， 用于前述亚磷酰胺法的甘氨酸残基(Gly)引入用分子和甘氨酸二聚体残基 (GlyGly)引入用分子通过下述方法合成。这些甘氨酸残基(Gly)引入用分子和 甘氨酸二聚体残基(GlyGly)引入用分子为亚酰胺，其对应于前述本发明的单 体。前述亚酰胺的去保护依照常规方法，并且合成的微小RNA抑制剂通过 HPLC纯化。

[实施例2：海棉寡核苷酸(实施例)和单体假目标(decoy)寡核苷酸(参考例) 对HCT116细胞中hsa-miR-16-5p(miR-16)活性的抑制效果的比较]

(1)材料

1-a:寡核苷酸

如下述碱基序列和下列表1所示，其中与hsa-miR-16-5p(微小RNA)互补 的序列通过Gly(前述G1)或GlyGly(前述G2)连接的微小RNA抑制剂用于测量 它们的微小RNA抑制效果(微小RNA抑制活性)。在下文中，hsa-miR-16-5p简 称为“miR-16”。在本实施例和下述各实施例(包括参考例)中，除非另有说明， 微小RNA为miR-16。

在本实施例(实施例2)和下列各实施例中，具有与微小RNA的序列互补 的两个以上的序列的微小RNA抑制剂指“海绵寡核苷酸(sponge oligonucleotide)”或“海绵低聚体(sponge oligo)”。仅具有一个与微小RNA的序 列互补的序列的微小RNA抑制剂(参考例)指“单体假目标寡核苷酸”或“单体 假目标”。此外，在本实施例(实施例2)和下列各实施例中，“完美型”意指具 有图3(a)的完全匹配结构的微小RNA抑制剂，“凸型”是指具有图3(b)的错配结 构的微小RNA抑制剂，和“泡型”是指具有图3(c)的错配结构的微小RNA抑制 剂。

(实施例2-1)

spo-D-3(含Gly的泡型海绵低聚体)

5’-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA -Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3’(SEQ ID NO:2)

(参考例2-1)

spo-D-7(含Gly的泡型单体假目标)

5’-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3’(SEQ ID NO:3)

(实施例2-2)

spo-D-13(含GlyGly的完美型海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGT GCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:4)

(参考例2-2)

spo-D-14(含GlyGly的完美型单体假目标)

5’-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:5)

(实施例2-3)

spo-D-16(含GlyGly的泡型海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGC TGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO: 6)

(参考例2-3)

spo-D-17(含GlyGly的泡型单体假目标)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:7)

作为上述实施例2-1-2-3各自的阴性对照，使用下述参考例2-4-2-6。

(参考例2-4)

spo-D-9(含Gly的泡型海绵低聚体阴性对照)

5’-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA- Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3’(SEQ ID NO:8)

(参考例2-5)

spo-D-18(含Gly Gly的完美型海绵低聚体阴性对照)

5’-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTA ATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:9)

(参考例2-6)

spo-D-20(含Gly Gly的泡型海绵低聚体阴性对照)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTAT AAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO: 10)

此外，作为下述参考例2-7和2-8的微小RNA抑制剂，使用对miR-16活性 的抑制效果的阳性对照(LNA-miR16)，和为其阴性对照(LNA-阴性对照 (Neg.Con))的下列LNA分子(由EXIQON制造)。

(参考例2-7)

hsa-miR-16 miRCURY LNA微小RNA强力抑制剂(Power inhibitor) (426845-00)(LNA-miR16)

GCCAATATTTACGTGCTGCT(SEQ ID NO:11)

(参考例2-8)

miRCURY LNATM微小RNA强力反义对照B(199021-00)(LNA-阴性对照)

AGAGCTCCCTTCAATCCAAA(SEQ ID NO:12)

利用注射用蒸馏水制备上述寡核苷酸水溶液，浓度为10μM。

表1

1-b：细胞系和培养基

使用的细胞系为人结肠癌细胞系HCT116(ATCC)。作为培养基，含10％ FBS的DMEM培养基(Nacalai)用于37℃下10％CO2的存在下培养。

1-c：报告质粒

作为报告质粒，使用含下列报告基因的质粒。

(1)pGL4-miR16

Promega KK的pGL4.74[hRluc/TK]载体，如图5所示，为在HSV-TK启动 子的调控下表达海肾荧光素基因的质粒。pGL4-miR16为在该载体中的荧光 素酶基因下游包括miR-16靶序列的质粒，其具有通过miR-16的活性抑制荧光 素酶表达水平的结构。

(2)pGL4-NTC

pGL4-NTC为包括在前述pGL4.74[hRluc/TK]载体的荧光素酶基因下游 不与miR-16反应的非特异性序列的质粒，并用作pGL4-miR16的对照。

(3)pMIR-REPORT荧光素酶

Ambion的pMIR-REPORT荧光素酶，如图6所示，为在CMV启动子的调 控下表达萤火虫荧光素基因的质粒。其通过与前述pGL4-miR16或前述 GL4-NTC共转染用于监控转染效率。

(2)方法

2-a：报告基因向HCT116细胞的转染

前述HCT116细胞以1x105/cm2的密度涂板于6cm皿上，并在无抗生素的 DMEM培养基(10％FBS)中培养。另外，制备添加有pGL4-NTC(2μg)和 pMIR-REPORT(2μg)的OptiMEM(Gibco,500μl)或添加有pGL4-miR16(2μg)和 pMIR-REPORT(2μg)的OptiMEM(溶液A)。另外，将Lipofectamine 2000 (Invitrogen,20μL)加入另一管OptiMEM(500μL)中(溶液B)。将两溶液搅拌均 匀，室温静置5分钟，将溶液A和溶液B混合，并室温静置20分钟，在此期间 将前述涂布细胞的培养基更换为新培养基。20分钟后，将前述溶液A和溶液 B的混合物添加至前述包含细胞的培养基，并继续在37℃下10％CO2的存在 下培养8小时。之后，将前述细胞的培养基更换为新培养基。

2-b：海绵低聚体、单体假目标或LNA向HCT116细胞的转染

回收转染有前述报告基因的HCT116细胞，并以5x104/孔涂板于24孔皿 上。接着，转染有前述pGL4-NTC和pMIR-REPORT的细胞和转染有前述 pGL4-miR16和pMIR-REPORT的细胞各自转染海绵低聚体、单体假目标或 LNA。首先，前述10μM海绵低聚体溶液、前述LNA溶液(1.25μL)或前述10μM 单体假目标溶液(3.75μL)加入OptiMEM(50μL)以制备溶液C。另外，脂质体 RNAiMAX(Invitrogen,2μL)加入OptiMEM(50μL)以制备溶液D。溶液C和溶 液D各自室温静置5分钟，溶液C和溶液D混合，并室温静置20分钟，在此期 间将前述涂布细胞的培养基更换为新培养基。20分钟后，将前述溶液C和溶 液D的混合物加入前述含转染有前述报告基因的HCT116细胞的培养基，并继 续在37℃在10％CO2的存在下培养24小时。之后，将前述细胞的培养基更换 为新培养基。通过转染，海绵低聚体或LNA的浓度为25nM，单体假目标的 终浓度为75nM。

2-c：活性测量

前述海绵低聚体、单体假目标或LNA转染48小时后，各细胞的荧光素酶 活性通过双荧光素酶(Dual-Luciferase)(注册商标)报告分析体系(Promega KK) 根据所附实验方案测量。所用测量装置为Berthold Centro 960(Berthold)。

2-d：活性分析

如上所述，pMIR-REPORT-来源的萤火虫荧光素反应转染效率， pGL4-NTC和pGL4-miR16-来源的海肾荧光素反应miR-16活性。因此，标准 化海肾荧光素活性值通过将海肾荧光素的活性值(ApGL4-NTC或ApGL4-miR16)除以 萤火虫荧光素的活性值(ApMIR-REPORT(NTC)或ApMIR-REPORT(miR-16))来获得。基于为1 的源自pGL4-NTC的海肾荧光素的标准化活性值的源自pGL4-miR16的海肾 荧光素的活性值为被miR-16抑制的值。因此，海绵低聚体、单体假目标和LNA 各自的miR-16活性抑制效果的值通过下列计算式获得。

(3)结果

所得结果示于图7-9。图7-9中的纵轴示出miR-16活性抑制效果(也指活性 抑制效果或活性抑制能力)。其同样适用于下述图10-19。图7示出使用含Gly 的泡型海绵低聚体获得的结果(实施例2-1)，图8示出使用含GlyGly的完美型 海绵低聚体获得的结果(实施例2-2)，图9示出使用含GlyGly的泡型海绵低聚 体获得的结果(实施例2-3)。如图所示，在所有情况下，海绵低聚体示出具有 可与LNA相比的miR-16活性抑制能力。另外，本实施例的海绵低聚体的优势 在于，由于其结构，与LNA相比，便利性极其优异，且具有高度广泛的实用 性。在本实施例中，为了给出与海绵低聚体和单体假目标的与miR-16结合的 序列数量相同，单体假目标以海绵低聚体三倍的浓度使用；然而，海绵低聚 体显示比单体假目标更高的miR-16活性抑制能力。这表明在海绵低聚体中发 生miRNA的协调结合。

[实施例3：HCT116细胞中DNA型海绵低聚体和RNA型海绵低聚体对 miR-16性的抑制效果]

(1)材料

1-a：寡核苷酸

如下述碱基序列和下列表2所示，使用其中与miR-16(微小RNA)互补的 序列通过GlyGly(前述G2)连接的微小RNA抑制剂来测量它们的微小RNA抑 制效果(微小RNA抑制活性)。

(实施例3-1)

spo-D-16(含GlyGly的泡型DNA海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGC TGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:6)

(实施例3-2)

spo-R-16(含GlyGly的泡型RNA海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGA UGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3’ (SEQ ID NO:13)

对于其中每一个都使用下列阴性对照低聚体。

(参考例3-1)

spo-D-20(含GlyGly的泡型DNA海绵低聚体阴性对照)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTAT AAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:10)

(参考例3-2)

spo-R-20(含GlyGly的泡型RNA海绵低聚体阴性对照)

5’-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCA UUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-U-3’ (SEQ ID NO:14)

此外，作为下列参考例3-3和3-4的微小RNA抑制剂，使用对miR-16活性 具有抑制效果的阳性对照(LNA-miR16)，和下列为其阴性对照的LNA分子(由 EXIQON制造)(LNA-阴性对照)。参考例3-3与前述参考例2-7相同，参考例3-4 与前述参考例2-8相同。

(参考例3-3)

LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT(SEQ ID NO:11)

(参考例3-4)

LNA-阴性对照AGAGCTCCCTTCAATCCAAA(SEQ ID NO:12)

利用注射用蒸馏水制备上述寡核苷酸水溶液至10μM。

表2

1-b：细胞系

所用细胞系和培养基与实施例2中的那些相同。

1-c：报告质粒

作为报告质粒，使用包含与实施例2相同报告基因的质粒。

(2)方法

2-a：报告基因向HCT116细胞的转染

使用HCT116细胞并以与实施例2相同的方式，将报告基因质粒 pGL4-NTC(2μg)和pMIR-REPORT(2μg)或者pGL4-miR16(2μg)和 pMIR-REPORT(2μg)各自转染至HCT116细胞。

2-b：海绵低聚体、LNA向细胞的转染

海绵低聚体或LNA通过与实施例A2类似的方法转染至转染有前述报告 基因的细胞。作为转染结果，海绵低聚体和LNA的终浓度为25nM。

2-c：活性测量

前述海绵低聚体或LNA转染48小时后，各细胞的荧光素酶活性通过双荧 光素酶(注册商标)报告分析体系(Promega KK)根据所附实验方案测量。所用 测量装置为Berthold Centro 960(Berthold)。

2-d：活性分析

通过与实施例2类似的方法，获得miR-16活性抑制效果的值。

(3)结果

所得结果示于图10。如图所示，实施例的DNA型海绵低聚体和RNA型海 绵低聚体与阴性对照相比均示出极高的miR-16活性抑制能力。此外，实施例 的DNA型海绵低聚体和RNA型海绵低聚体的优势在于，由于其结构，与LNA 相比，它们的便利性极其优异，且具有高度广泛的实用性。另外，本实施例 DNA型海绵低聚体显示比RNA型海绵低聚体高的miR-16活性抑制能力，且 具有可与LNA相比的高miR-16活性抑制能力。

在本实施例中，如上所述，DNA型海绵低聚体显示比RNA型海绵低聚 体高的微小RNA活性抑制效。本发明中，RNA型海绵低聚体可能具有比DNA 型海绵低聚体高的微小RNA活性抑制能力，取决于靶miRNA的种类，或者当 细胞系与本实施例不同时等。

[实施例4：HCT116细胞和HEK293T细胞中具有不同连接子分子的海绵 低聚体的miR-16活性抑制效果的比较]

(1)材料

1-a：寡核苷酸

如下述碱基序列和下列表3所示，使用其中与miR-16互补的序列通过Gly (前述G1)、GlyGly(前述G2)或TPA连接的微小RNA抑制剂来测量它们的微小 RNA抑制效果(微小RNA抑制活性)。

(实施例4-1)

spo-D-3(含Gly的泡型海绵低聚体)

5’-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA -Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3’(SEQ ID NO:2)

(实施例4-2)

spo-D-16(含GlyGly的泡型海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGC TGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO: 6)

(实施例4-3)

spo-D-13(含GlyGly的完美型海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGT GCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:4)

(实施例4-4)

spo-D-15(含TPA的完美型海绵低聚体)

5’-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTG CTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3’(SEQ ID NO:15)

(实施例4-5)

spo-D-21(含TPA的泡型海绵低聚体)

5’-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCT A-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3’(SEQ ID NO:16)

(实施例4-6)

spo-D-22(含TPA的凸型海绵低聚体)

5’-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTT CCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3’

(SEQ ID NO:17)

(实施例4-7)

spo-D-23(含GlyGly的凸型海绵低聚体)

5’-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTA GTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGl y-T-3’(SEQ ID NO:18)

作为前述实施例4-1-4-7的阴性对照低聚体，使用其中下列碱基序列通 过Gly(前述G1)或GlyGly(前述G2)连接的微小RNA抑制剂(下列参考例4-1- 4-4)来测量微小RNA抑制效果(微小RNA抑制活性)。

(参考例4-1)

spo-D-9(含Gly的泡型海绵低聚体阴性对照)

5’-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA- Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3’(SEQ ID NO:8)

(参考例4-2)

spo-D-20(含GlyGly的泡型海绵低聚体阴性对照)

5’-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTAT AAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO: 10)

(参考例4-3)

spo-D-18(含GlyGly的完美型海绵低聚体阴性对照)

5’-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTA ATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3’(SEQ ID NO:9)

(参考例4-4)

spo-D-19(含TPA的完美型海绵低聚体阴性对照)

5’-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTA CA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3’(SEQ ID NO:19)

此外，作为下列参考例4-5和4-6的微小RNA抑制剂，使用对miR-16活性 具有抑制效果的阳性对照(LNA-miR16)，和为其阴性对照的下列LNA分子(通 过EXIQON制造)(LNA-阴性对照)。参考例4-5与前述参考例2-7相同，参考例 4-6与前述参考例2-8相同。

(参考例4-5)

LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT(SEQ ID NO:11)

(参考例4-6)

LNA-阴性对照AGAGCTCCCTTCAATCCAAA(SEQ ID NO:12)

上述寡核苷酸溶于注射用蒸馏水至10μM，从而制备RNA溶液。

表3

1-b：细胞系和培养基

所用细胞系为人结肠癌细胞系HCT116(ATCC)或人胚胎肾细胞系 HEK293T(ATCC)。作为培养基，含10％FBS的DMEM培养基(Nacalai)用于 在37℃在10％CO2的存在下培养。

1-c：报告质粒

作为报告质粒，使用包含与实施例2相同报告基因的质粒。

(2)方法

2-a：报告基因向HCT116细胞或HEK293T细胞的转染

使用HCT116细胞或293T细胞并以与实施例2相同的方式，各自转染报告 基因质粒pGL4-NTC(2μg)和pMIR-REPORT(2μg)，或者pGL4-miR16(2μg)和 pMIR-REPORT(2μg)。

2-b：海绵低聚体或LNA向HCT116细胞或HEK293T细胞的转染

海绵低聚体或LNA通过与实施例A2类似的方法转染至转染有前述报告 基因的细胞。作为转染结果，海绵低聚体和LNA的终浓度为25nM。

2-c：活性测量

前述海绵低聚体或LNA向前述HCT116细胞或HEK293T细胞转染48小时 后，各细胞的荧光素酶活性通过双荧光素酶(注册商标)报告分析体系 (Promega KK)根据所附实验方案测量。所用测量装置为Berthold Centro 960 (Berthold)。

2-d：活性分析

通过与实施例2类似的方法，获得miR-16活性抑制效果的值。

(3)结果

所得结果示于图11至图17。图11示出通过使用HCT116细胞的Gly型海绵 低聚体和GlyGly型海绵低聚体的比较。结果发现，GlyGly型海绵低聚体具有 比Gly型稍强的抑制效果。图12至图17示出GlyGly型海绵低聚体和TPA型海绵 低聚体的比较。在图12至图14中，使用HCT116细胞，图15至图17示出通过 使用HEK293T细胞获得的结果。当使用完美型海绵低聚体时，TPA型在 HCT116细胞中示出较高的活性(图12)，二者的活性在HEK293T细胞中几乎相 同(图15)。当使用泡型海绵低聚体时，GlyGly型在HCT116细胞和HEK293T 细胞中均示出较高的活性(图13和16)。当使用凸型海绵低聚体时，TPA型在HCT116细胞中示出较高活性(图14)，GlyGly型在HEK293T细胞中示出较高活 性(图17)。从上述结果确认，在本实施例的海绵低聚体中，对于体外miR-16 活性，TPA型和GlyGly型示出比Gly型稍强的抑制活性。TPA型和GlyGly型的 miR-16活性抑制效果几乎没有差别。

[实施例5：具有不同miR-16结合序列的海绵低聚体在HCT116细胞和 HEK293T细胞中的miR-16活性抑制效果的比较]

(1)材料

1-a：寡核苷酸

如下述碱基序列和下列表4所示，使用其中与miR-16互补的序列通过 TPA连接的微小RNA抑制剂来测量它们的微小RNA抑制效果(微小RNA抑制 活性)。

(实施例5-1)

spo-D-15(含TPA的完美型海绵低聚体)

5’-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTG CTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3’(SEQ ID NO:15)

(实施例5-2)

spo-D-21(含TPA的泡型海绵低聚体)

5’-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCT A-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3’(SEQ ID NO:16)

(实施例5-3)

spo-D-22(含TPA的凸型海绵低聚体)

5’-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTT CCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3’ (SEQ ID NO:17)

作为前述实施例5-1-5-3的阴性对照低聚体，使用下列参考例5-1的微小 RNA抑制剂来测量微小RNA抑制效果(微小RNA抑制活性)。

(参考例5-1)

spo-D-19(含TPA的完美型海绵低聚体阴性对照)

5’-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTA CA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3’(SEQ ID NO:19)

此外，作为下列参考例5-2和5-3的微小RNA抑制剂，使用对miR-16活性 具有抑制效果的阳性对照(LNA-miR16)，和为其阴性对照的下列LNA分子(由 EXIQON制造)(LNA-阴性对照)。参考例5-2与前述参考例2-7相同，参考例5-3 与前述参考例2-8相同。

(参考例5-2)

LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT(SEQ ID NO:11)

(参考例5-3)

LNA-阴性对照AGAGCTCCCTTCAATCCAAA(SEQ ID NO:12)

用注射用蒸馏水制备上述寡核苷酸水溶液至10μM。

表4

1-b：细胞系

与实施例4相同的细胞系用于活性测量。

1-c：报告质粒

作为报告质粒，使用包含与实施例2相同的报告基因的质粒。

(2)方法

2-a：报告基因向HCT116细胞或HEK293T细胞的转染

使用HCT116细胞或HEK293T细胞并以与实施例A2相同的方式，将报告 基因质粒pGL4-NTC(2μg)和pMIR-REPORT(2μg)，或者pGL4-miR16(2μg)和 pMIR-REPORT(2μg)各自转染至HCT116细胞或HEK293T细胞。

2-b：海绵低聚体或LNA向HCT116细胞或HEK293T细胞的转染

海绵低聚体或LNA通过与实施例A2类似的方法转染至转染有前述报告 基因的细胞。作为转染结果，海绵低聚体和LNA的终浓度为25nM。

2-c：活性测量

前述海绵低聚体或LNA转染48小时后，各细胞的荧光素酶活性通过双荧 光素酶(注册商标)报告分析体系(Promega KK)根据所附实验方案测量。所用 测量装置为Berthold Centro 960(Berthold)。

2-d：活性分析

通过与实施例2类似的方法，获得miR-16活性抑制效果的值。

(3)结果

所得结果示于图18和19。图18示出通过使用HCT116细胞当miR-16结合 序列为完美型、泡型或凸型时海绵低聚体活性的比较。结果，这三种显示几 乎没有差别，但完美型和凸型示出对体外miR-16活性相当强的抑制效果。图 19示出通过使用HEK293T细胞当miR-16结合序列为完美型、泡型或凸型时海 绵低聚体活性的比较。结果，在这三种中，凸型显示对体外miR-16活性最强 的抑制效果。

在通过参考实施方案说明本发明的同时，本发明不受上述实施方案的限 制。本发明的构成和细节可在本发明的范围内进行各种改变，只要本领域普 通技术人员能够理解即可。

本申请基于在日本提交的专利申请2012-047466号(申请日：2012年3月4 日)，在此将其内容全部引入。

产业上的可利用性

由于本发明的微小RNA抑制剂不需要使用特定的修饰核酸，因而其广泛 的实用性优异，且由于前述互补序列经连接子残基连接(键合)而难以降解。 因此，本发明的微小RNA抑制剂可广泛用于各种领域。

附图标记翻译

1 微小RNA抑制剂

2 互补序列

3 连接子残基

序列表

110 株式会社博纳克

120 微小RNA抑制剂

130 TF13005WO

150 JP 2012-047466

151 2012-03-04

160 19

170 SIPOSequenceListing 1.0

210 1

211 21

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(21)

223 合成 DNA

400 1

cacaaaccat gcctgctgct a 21

210 2

211 64

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 DNA

400 2

cgccaatatt cgatgctgct acgccaatat tcgatgctgc tacgccaata ttcgatgctg 60

ctat 64

210 3

211 22

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(22)

223 合成 DNA

400 3

cgccaatatt cgatgctgct at 22

210 4

211 67

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(67)

223 合成 DNA

400 4

cgccaatatt tacgtgctgc tacgccaata tttacgtgct gctacgccaa tatttacgtg 60

ctgctat 67

210 5

211 23

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(23)

223 合成 DNA

400 5

cgccaatatt tacgtgctgc tat 23

210 6

211 64

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 DNA

400 6

cgccaatatt cgatgctgct acgccaatat tcgatgctgc tacgccaata ttcgatgctg 60

ctat 64

210 7

211 22

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(22)

223 合成 DNA

400 7

cgccaatatt cgatgctgct at 22

210 8

211 64

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 DNA

400 8

cgccaatatt ccattataag acgccaatat tccattataa gacgccaata ttccattata 60

agat 64

210 9

211 67

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(67)

223 合成 DNA

400 9

cgccaatatt tacgtaatta cacgccaata tttacgtaat tacacgccaa tatttacgta 60

attacat 67

210 10

211 64

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 DNA

400 10

cgccaatatt ccattataag acgccaatat tccattataa gacgccaata ttccattata 60

agat 64

210 11

211 20

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(20)

223 合成 DNA

400 11

gccaatattt acgtgctgct 20

210 12

211 20

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(20)

223 合成 DNA

400 12

agagctccct tcaatccaaa 20

210 13

211 64

212 RNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 RNA

400 13

cgccaauauu cgaugcugcu acgccaauau ucgaugcugc uacgccaaua uucgaugcug 60

cuau 64

210 14

211 64

212 RNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 RNA

400 14

cgccaauauu ccauuauaag acgccaauau uccauuauaa gacgccaaua uuccauuaua 60

agau 64

210 15

211 67

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(67)

223 合成 DNA

400 15

cgccaatatt tacgtgctgc tacgccaata tttacgtgct gctacgccaa tatttacgtg 60

ctgctat 67

210 16

211 64

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(64)

223 合成 DNA

400 16

cgccaatatt cgatgctgct acgccaatat tcgatgctgc tacgccaata ttcgatgctg 60

ctat 64

210 17

211 79

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(79)

223 合成 DNA

400 17

cgccaatatt tagttccgtg ctgctacgcc aatatttagt tccgtgctgc tacgccaata 60

tttagttccg tgctgctat 79

210 18

211 79

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(79)

223 合成 DNA

400 18

cgccaatatt tagttccgtg ctgctacgcc aatatttagt tccgtgctgc tacgccaata 60

tttagttccg tgctgctat 79

210 19

211 67

212 DNA

213 人工序列(Artificial Sequence)

220

221 gene

222 (1)..(67)

223 合成 DNA

400 19

cgccaatatt tacgtaatta cacgccaata tttacgtaat tacacgccaa tatttacgta 60

attacat 67